電泳是指帶電顆粒在電場的作用下發(fā)生遷移的過程。許多重要的生物分子，如氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、核苷酸、核酸等都具有可電離基團(tuán)，它們在某個特定的pH值下可以帶正電或負(fù)電，在電場的作用下，這些帶電分子會向著與其所帶電荷極性相反的電極方向移動。電泳技術(shù)就是利用在電場的作用下，由于待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)以及分子本身大小、形狀等性質(zhì)的差異，使帶電分子產(chǎn)生不同

的遷移速度，從而對樣品進(jìn)行分離、鑒定或提純的技術(shù)。

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    電泳過程必須在一種支持介質(zhì)中進(jìn)行。Tiselius等在1937年進(jìn)行的自由界面電泳沒有固定支持介質(zhì)，所以擴(kuò)散和對流都比較強(qiáng)，影響分離效果。于是出現(xiàn)了固定支持介質(zhì)的電泳，樣品在固定的介質(zhì)中進(jìn)行電泳過程，減少了擴(kuò)散和對流等干擾作用。**初的支持介質(zhì)是濾紙和醋酸纖維素膜，目前這些介質(zhì)在實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)應(yīng)用得較少。在很長一段時間里，小分子物質(zhì)如氨基酸、多肽、糖等通常用濾紙或纖維素、硅膠薄層平板為介質(zhì)的電泳進(jìn)行分離、分析，但目前則一般使用更靈敏的技術(shù)如HPLC等來進(jìn)行分析。這些介質(zhì)適合于分離小分子物質(zhì)，操作簡單、方便。但對于復(fù)雜的生物大分子則分離效果較差。凝膠作為支持介質(zhì)的引入大大促進(jìn)了電泳技術(shù)的發(fā)展，使電泳技術(shù)成為分析蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子的重要手段之一。**初使用的凝膠是淀粉凝膠，但目前使用得**多的是瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺

凝膠。蛋白質(zhì)電泳主要使用聚丙烯酰胺凝膠。 

     電泳裝置主要包括兩個部分：電源和電泳槽。電源提供直流電，在電泳槽中產(chǎn)生電場，驅(qū)動帶電分子的遷移。電泳槽可以分為水平式和垂直式兩類。垂直板式電泳是較為常見的一種，常用于聚丙烯酰胺凝膠電泳中蛋白質(zhì)的分離。電泳槽中間是夾在一起的兩塊玻璃板，玻璃板兩邊由塑料條隔開，在玻璃平板中間制備電泳凝膠，凝膠的大小通常是12cm  14 cm，厚度為1mm～2? mm，近年來新研制的電泳槽，膠面更小、更薄，以節(jié)省試劑和縮短電泳時間。制膠時在凝膠溶液中放一個塑料梳子，在膠聚合后移去，形成上樣品的凹槽。水平式電泳，凝膠鋪在水平的玻璃或塑料板上，用一薄層濕濾紙連接凝膠和電泳緩沖液，或?qū)⒛z直接浸入緩沖液中。由于pH值的改變會引起帶電分子電荷的改變，進(jìn)而影響其電泳遷移的速度，所以電泳過程應(yīng)在適當(dāng)?shù)木彌_液中進(jìn)行的，緩沖液可以保持待分離物的帶電

性質(zhì)的穩(wěn)定。 

    為了更好的了解帶電分子在電泳過程中是如何被分離的，下面簡單介紹一下電泳的基本原理。在兩個平行電極上加一定的電壓（V），

就會在電極中間產(chǎn)生電場強(qiáng)度（E），L是電極間距離。

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    在稀溶液中，電場對帶電分子的作用力（F），等于所帶凈電荷與電場強(qiáng)度的乘積。這個作用力使得帶電分子向其電荷相反的電極方向移動。在移動過程中，分子會受到介質(zhì)粘滯力的阻礙。粘滯力（F’）的大小與分子大小、形狀、電泳介質(zhì)孔徑大小以及緩沖液粘度等有關(guān)，并與帶電分子的移動速度成正比，對于球狀分子，F(xiàn)’的大小服從Stokes定律，即：F’=6πrηυ式中r是球狀分子的半徑，η是緩沖液粘度，υ是電泳速度(υ= d / t，單位時間粒子運(yùn)動的距離，cm / s )。當(dāng)帶電分子勻速移動時： F = F’，q?E = 6πrηυ

由此可以看出，遷移率與帶電分子所帶凈電荷成正比，與分子的大小和緩沖液的粘度成反比。 

       用SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳測定蛋白質(zhì)分子量時，實(shí)際使用的是相對遷移率mR。帶電分子由于各自的電荷和形狀大小不同，因而在電泳過程中具有不同的遷移速度，形成了依次排列的不同區(qū)帶而被分開。即使兩個分子具有相似的電荷，如果它們的分子大小不同，由于它們所受的阻力不同，因此遷移速度也不同，在電泳過程中就可以被分離。有些類型的電泳幾乎完全依賴于分子所帶的電荷不同進(jìn)行分離，如等電聚焦電泳；而有些類型的電泳則主要依靠分子大小的不同即電泳過程中產(chǎn)生的阻力不同而得到分離，如SDS－聚丙烯酰胺

凝膠電泳。分離后的樣品通過各種方法的染色，或者如果樣品有放射性標(biāo)記，則可以通過放射性自顯影等方法進(jìn)行檢測。 

凝膠電泳的實(shí)驗(yàn)原理 

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  聚丙烯酰胺凝膠電泳，普遍用于分離蛋白質(zhì)及較小分子的核酸。瓊脂糖凝膠孔徑較大適用于分離同工酶及其亞型，大分子核酸等應(yīng)用較廣。瓊脂糖和聚丙烯酰胺可以制成各種形狀、大小和孔隙度。瓊脂糖凝膠分離DNA片度大小范圍較廣,不同濃度瓊脂糖凝膠可分離長度從200bp**近50kb的DNA片段。瓊脂糖通常用水平裝置在強(qiáng)度和方向恒定的電場下電泳。聚丙烯酰胺分離小片段DNA(5-500bp)效果較好,其分辯力極高,甚**相差1bp的DNA片段就能分開。聚丙烯酰胺凝膠電泳很快,可容納相對大量的DNA,但制備和操作比瓊脂糖凝膠困難。

聚丙烯酰胺凝膠采用垂直裝置進(jìn)行電泳。目前,一般實(shí)驗(yàn)室多用瓊脂糖水平平板凝膠電泳裝置進(jìn)行DNA電泳。  

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瓊脂糖凝膠電泳原理： 

       瓊脂糖是從瓊脂中提純出來的，主要是由D－半乳糖和3,6脫水L－半乳糖連接而成的一種線性多糖。瓊脂糖凝膠的制作是將干的瓊脂糖懸浮于緩沖液中，通常使用的濃度是1％－3％，加熱煮沸**溶液變?yōu)槌吻?，注入模板后室溫下冷卻凝聚即成瓊脂糖凝膠。瓊脂糖主要在DNA制備電泳中作為一種固體支持基質(zhì)。瓊脂糖之間以分子內(nèi)和分子間氫鍵形成較為穩(wěn)定的交聯(lián)結(jié)構(gòu)，這種交聯(lián)的結(jié)構(gòu)使瓊脂糖凝膠有較好的抗對流性質(zhì)。瓊脂糖凝膠的孔徑可以通過瓊脂糖的**初濃度來控制，低濃度的瓊脂糖形成較大的孔徑，而高濃度的瓊脂糖形成較小的孔徑。盡管瓊脂糖本身沒有電荷，但一些糖基可能會被羧基、甲氧基特別是硫酸根不同程度的取代，使得瓊脂糖凝膠表面

帶有一定的電荷，引起電泳過程中發(fā)生電滲以及樣品和凝膠間的靜電相互作用，影響分離效果。 

     瓊脂糖凝膠可以用于蛋白質(zhì)和核酸的電泳支持介質(zhì)，尤其適合于核酸的提純、分析。如濃度為1％的瓊脂糖凝膠的孔徑對于蛋白質(zhì)來說是比較大的，對蛋白質(zhì)的阻礙作用較小，這時蛋白質(zhì)分子大小對電泳遷移率的影響相對較小，所以適用于一些忽略蛋白質(zhì)大小而只根據(jù)蛋白質(zhì)天然電荷來進(jìn)行分離的電泳技術(shù)，如免疫電泳、平板等電聚焦電泳等。瓊脂糖也適合于DNA、RNA分子的分離、分析，由于DNA、RNA分子通常較大，所以在分離過程中會存在一定的摩擦阻礙作用，這時分子的大小會對電泳遷移率產(chǎn)生明顯影響。例如對于雙鏈DNA，電泳遷移率的大小主要與DNA分子大小有關(guān)，而與堿基排列及組成無關(guān)。另外，一些低熔點(diǎn)的瓊脂糖（62 C時熔化，因此其中的樣品如

DNA可以重新溶解到溶液中而回收。 

       由于瓊脂糖凝膠的彈性較差，難以從小管中取出，所以一般瓊脂糖凝膠不適合于管狀電泳，管狀電泳通常采用聚丙烯酰胺凝膠。瓊脂糖凝膠通常是形成水平式板狀凝膠，用于等電聚焦、免疫電泳等蛋白質(zhì)電泳，以及DNA、RNA的分析。垂直式電泳應(yīng)用得相對較少。 

目前多用瓊脂糖為電泳支持物進(jìn)行平板電泳，其優(yōu)點(diǎn)如下： 

1） 瓊脂糖凝膠電泳操作簡單，電泳速度快，樣品不需事先處理就可以進(jìn)行電泳。

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2） 瓊脂糖凝膠結(jié)構(gòu)均勻，含水量大（約占98%~99%），近似自由電泳，樣品擴(kuò)散較自由電流，對樣品吸附極微，因此電泳圖譜清晰，分

辨率高，重復(fù)性好。 

3） 瓊脂糖透明無紫外吸收，電泳過程和結(jié)果可直接用紫外光燈檢測及定量測定。 4） 電泳后區(qū)帶易染色，樣品極易洗脫，便于定量測定。制成干膜可長期保存。 

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聚丙烯酰胺凝膠電泳原理：0 |( F# p# ?2 G6 v* x9 x-  

       聚丙烯酰胺凝膠電泳簡稱為PAGE（Polyacrylamide gel electrophoresis），是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)。聚丙烯酰胺凝膠是由單體的丙烯酰胺（CH2=CHCONH2 Acrylamide）和甲叉雙丙烯酰胺（CH2(NHCOHC=CH2) 2 N,N’-methylenebisacrylamide）聚合而成，這一聚合過程需要有自由基催化完成。常用的催化聚合方法有兩種：化學(xué)聚合和光聚合?；瘜W(xué)聚合通常是加入催化劑過硫酸銨（AP）以及加速劑四甲基乙二胺（TEMED），四甲基乙二胺催化過硫酸銨產(chǎn)生自由基。溶液的pH對聚合作用是重要的，因?yàn)檫^低pH沒有足夠的堿基加速催化反應(yīng)，同樣過多的氧分子存在，會使聚合作用很快停止。所以制備凝膠時，在加過硫酸銨之前，混合物必須抽去空氣。核黃素催化的聚合作用，常用于制備濃縮膠，因?yàn)檫@樣制得的凝膠孔度要大些。核黃素在光照射下及有微量氧存在時，產(chǎn)生自由基使Acr

發(fā)生聚合作用。 

  

    聚丙烯酰胺凝膠的孔徑可以通過改變丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺的濃度來控制，丙烯酰胺的濃度可以在3％－30％之間。低濃度的凝膠具有較大的孔徑，如3％的聚丙烯酰胺凝膠對蛋白質(zhì)沒有明顯的阻礙作用，可用于平板等電聚焦或SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳的濃縮膠，也可以用于分離DNA；高濃度凝膠具有較小的孔徑，對蛋白質(zhì)有分子篩的作用，可以用于根據(jù)蛋白質(zhì)的分子量進(jìn)行分離的電泳中，如10％－20％的凝膠常用于SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳的分離膠。選擇T和C的經(jīng)驗(yàn)公式是：C = 6.5－0.3T此式可用于計(jì)算T為5％～20％時的凝膠組成。C值并不很嚴(yán)格，在大多數(shù)情況下，可變化的范圍約為 1％，當(dāng)C保持恒定時，凝膠的有效孔徑隨著T的增加而減小，當(dāng)T保持恒定，C為4％時，有效孔徑**小，C大于或小于4％時，有效孔徑均變大，C大于5％時凝膠變脆，不宜使用，實(shí)驗(yàn)中**常用的C

是2.6％和3％。

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    由于聚丙烯酰胺凝膠有突出的優(yōu)點(diǎn)，因而四十年來得到廣泛的應(yīng)用，目前尚無更好的支持介質(zhì)能夠取代它。其主要的優(yōu)點(diǎn)有： 

1、 可以隨意控制膠濃度“T”和交聯(lián)度“C”，從而得到不同的有效孔徑，用于分離不同分子量的生物大分子。

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2、 能把分子篩作用和電荷效應(yīng)結(jié)合在同一方法中，達(dá)到更高的靈敏度：10－9 ～10－12 mol/L。#p#分頁標(biāo)題#e#

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3、 由于聚丙烯酰胺凝膠是由－C－C－鍵結(jié)合的酰胺多聚物，側(cè)鏈只有不活潑的酰胺基－CO－NH2 ，沒有帶電的其他離子基團(tuán)，化學(xué)惰

性好，電泳時不會產(chǎn)生“電滲”。

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4、 由于可以制得高純度的單體原料，因而電泳分離的重復(fù)性好。 

5、 透明度好，便于照相和復(fù)印。機(jī)械強(qiáng)度好，有彈性，不易碎，便于操作和保存。 

6、 無紫外吸收，不染色就可以用于紫外波長的凝膠掃描作定量分析。

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7、 還可以用作固定化酶的惰性載體。核酸電泳指示劑的選擇 

指示劑：

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       核酸電泳常用的指示劑有溴酚蘭和二甲苯青及銀染色.溴酚蘭在堿性液體中 呈紫蘭色，在0.6%、1%、1.4%和2%瓊脂糖凝膠電泳中，溴酚蘭的遷移率分別與1Kb、 0.6Kb、0.2Kb和0.15Kb的雙鏈線性DNA片段大致相同.二甲苯青的水溶液呈蘭色，它在 1%和1.4%瓊

脂糖中電泳時，其遷移速率分別與2Kb和1.6Kb的雙鏈線性DNA大致相似。

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指示劑一般與蔗糖、甘油或聚蔗糖400組成載樣緩沖液.載樣緩沖液的作用有： 1、 增加樣 品密度，使其比重增加，以確保DNA均勻沉入加樣孔內(nèi)。

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2、 在電泳中形成肉眼可見的指 示帶，可預(yù)測核酸電泳的速度和位置。 

3、 使樣品呈色，使加樣操作更方便。 

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染色劑：

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   核酸電泳后，需經(jīng)染色后才能顯現(xiàn)出帶型，**常用的是溴化乙錠染色法，其次是銀染色。( S( U) ~$ {. W( b

 

   溴化乙錠(ethidium bromide，EB)是一種熒光染料，EB分子可嵌入核酸雙鏈的堿基對之間，在紫外線激發(fā)下，發(fā)出紅色熒光.根據(jù)情況可在凝膠電泳液中加入終濃度為 0.5ug/ml的EB，有時亦可在電泳后，將凝膠浸入該濃度的溶液中染色10～15min.瓊脂 糖凝膠EB染色，肉眼可見核酸電泳帶，其DNA量一般>5ng，當(dāng)溴化乙錠太多，凝膠染 色過深，核酸電泳帶看不清時，可將凝膠放入蒸餾水浸泡30min

后再觀察。 

  銀染色液中的銀離子(Ag+)可與核酸形成穩(wěn)定的復(fù)合物，然后用還原劑如甲醛 使Ag+還原成銀顆粒，可把核酸電泳帶染色黑褐色.主

要用于聚丙烯酰胺凝膠電泳染色. 也用于瓊脂糖凝膠染色.其靈敏度比EB高200倍.但銀染色后，DNA不宜回收。 

瓊脂糖凝膠電泳 

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主要試劑： 

  核酸電泳緩沖液有三種，即Tris-硼酸(TBE)、Tris-乙酸(TAE)和Tris-磷酸(TPE).TBE與TPE緩沖容量高，DNA分離效果好，但TPE在DNA片段回收時含磷酸鹽濃度高，容易使DNA沉淀.TAE緩沖容量低，但價格較便宜，因而推薦選用TBE.緩沖液中的EDTA可螯合二價

陽離子，從而抑制DNA酶的活性，防止PCR擴(kuò)增產(chǎn)物降解。

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核酸分離一般用連續(xù)緩沖體系，常用的有：

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1) TBE：0.08mol/l Tris·HCl，pH8.5，0.08mol/L硼酸，0.0024mol/l EDTA 2) THE：0.04mol/l Tris·HCl。pH7.8，0.2mol/L醋酸鈉，0.0018mol/l EDTA 

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主要實(shí)驗(yàn)步驟：" |, j( H& a( e' U! ~( j. ?

 

1、 用蒸餾水將電泳槽和梳子沖洗干凈.放在水平桌面上，并架好梳子。# h& N' |' a' v0 u% i+ J. i

 2、 取5×TBE緩沖液20ml加水**200ml,配制成0.5×TBE稀釋緩沖液,待用。 

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3、 膠液的制備：稱取0.4g瓊脂糖,置于200ml錐形瓶中,加入50ml 0.5×TBE稀釋緩沖液,放入微波爐里(或電爐上)加熱**瓊脂糖全部熔化,取出搖勻,此為0.8％瓊脂糖凝膠液。加熱過程中要不時搖動,使附于瓶壁上的瓊脂糖顆粒進(jìn)入溶液。加熱時應(yīng)蓋上封口膜,以減少水

份蒸發(fā)。 

4、 膠板的制備：將有機(jī)玻璃膠槽兩端分別用橡皮膏(寬約1cm)緊密封住。將封好的膠槽置于水平支持物上,插上樣品梳子,注意觀察梳子齒下緣應(yīng)與膠槽底面保持1mm左右的間隙。向冷卻**50-60℃的瓊脂糖膠液中加入溴化乙錠(EB溶液使其終濃度為0.5μg /ml(也可不把EB加入凝膠中,而是電泳后再用0.5μg/ml的EB溶液浸泡染色)。用移液器吸取少量融化的瓊脂糖凝膠封橡皮膏內(nèi)側(cè),待瓊脂糖溶液凝固后將剩余的瓊脂糖小心地倒入膠槽內(nèi),使膠液形成均勻的膠層。倒膠時的溫度不可太低,否則凝固不均勻,速度也不可太快,否則容易出現(xiàn)氣泡。待膠完全凝固后撥出梳子,注意不要損傷梳底部的凝膠,然后向槽內(nèi)加入0.5×TBE稀釋緩沖液**液面恰好沒過膠板上表面。因邊緣

效應(yīng)樣品槽附近會有一些隆起,阻礙緩沖液進(jìn)入樣品槽中,所以要注意保證樣品槽中應(yīng)注滿緩沖液。

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   瓊脂糖濃度的配置可參照下表#p#分頁標(biāo)題#e#